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服务介绍/ Service Introduction
磷酸化蛋白质组通过TiO2/IMAC富集磷酸化肽段，利用LC-MS/MS在全局范围鉴定和定量蛋白质磷酸化修饰，是研究信号通路激活和调控机制的核心手段。
实验原理/ Experimental Principle
磷酸化蛋白质组原理：蛋白质磷酸化(Ser/Thr/Tyr)是重要翻译后修饰。磷酸化肽段经TiO2/IMAC富集后，通过LC-MS/MS检测磷酸肽段和定位磷酸化位点。磷酸化调控信号通路、酶活性和蛋白质互作，是细胞信号传导的核心机制。
应用领域/ Applications
- 全磷蛋白组磷酸化位点鉴定与定量
- 信号通路上游激酶活性推断
- 蛋白kinome活性/底物反映
- 磷酸化动态变化研究
- HNK磷酸化对功能调节
- 磷酸化依赖信号网络重构
服务优势/ Service Advantages
- 全局覆盖：鉴定数千个磷酸化位点
- 位点特异性：精确定位磷酸化Ser/Thr/Tyr
- 多组学整合：与蛋白质组联合分析
- 信号通路研究利器
服务流程/ Service Process
- 蛋白提取酶切
- 磷酸化肽段富集（TiO2/Fe-IMAC）
- 富集效率验证
- nanoLC-MS/MS分析（DDA/DIA模式）
- 磷酸化位点定位（MaxQuant ptmRS）
- 定量分析
- 信号通路分析
客户提供/ Supplied by Customer
| 项目 | 要求 |
|---|---|
| 样品 | 蛋白>=500ug-1mg/样本（磷酸化富集需大量蛋白） |
| 样本数量 | >=2组 每组>=3重复 |
| 分组 | 对照/实验组 |
| 修饰类型 | 磷酸化（Ser/Thr/Tyr） |
| 分析需求 | 磷酸化位点/差异定量/通路分析 |
结果展示/ Results
磷酸化位点列表（含位点/倍数变化/p-value）、火山图、motif分析、信号通路富集及实验报告。
最终交付/ Final Delivery
磷酸化位点列表（含位点/倍数变化/p-value）、火山图、motif分析、信号通路富集及实验报告。
Q&A/ FAQ
Q: 磷酸化富集效率低怎么办
起始蛋白量充足（>=1mg）、富集前除去非磷酸化肽段干扰（使用TiO2 selectivity enhancement with DHB/乳酸）、富集后检查富集效率（>80%磷酸化肽段占比）。使用Ti-IMAC比TiO2效果更好。
Q: 磷酸化位点定位概率多少可信
ptmRS或Ascore计算位点定位概率。概率>0.75（Class I）认为可靠定位；0.25-0.75（Class II）需要手工验证。建议取Class I位点分析。
Q: 磷酸化蛋白质组怎么做
1)蛋白提取+胰酶消化(需磷酸酶抑制剂防止去磷酸化)；2)TiO2/IMAC富集磷酸化肽段(去除非磷酸肽段)；3)富集后肽段LC-MS/MS分析(HCD/CID/EThcD碎裂)；4)搜库(MaxQuant/Mascot/MSFragger)定位磷酸化位点。需2-5mg总蛋白起始(磷酸肽段丰度低，占肽段总量1-5%)。
Q: 磷酸化位点怎么定位
碎片离子(phospho-site-determining ions)如b/y离子含有磷酸基团(增加80Da)。磷酸位点定位概率(PTM localization probability)>0.75为可信位点(Class I site)。EThcD碎裂(ETD+HCD混合)保留磷酸基团(不丢失H3PO4)，提高位点定位准确性。建议用EThcD碎裂模式提高磷酸位点定位率。
Q: 磷酸化富集方法
1)TiO2(二氧化钛)：富集磷酸化肽段，容量大、非特异结合低，适合Ser/Thr磷酸肽。2)IMAC(Fe3+-NTA)：富集磷酸化肽段，适合多磷酸化肽段。3)TiO2+IMAC双富集：提高覆盖。4)pY100抗体免疫沉淀：富集酪氨酸磷酸化(占磷酸化1-2%，需抗体富集)。建议TiO2(总磷酸化)+pY100(Tyr磷酸化)分别富集。
Q: 磷酸化蛋白质组需要多少蛋白
2-5mg总蛋白(胰酶消化后肽段)。磷酸化肽段仅占总肽段1-5%，需大量起始蛋白+富集提高覆盖率。TMT标记+TiO2富集可定量磷酸化(10-16通道同时定量磷酸化变化)。建议10mg起始蛋白(深度磷酸化蛋白质组)。FFPE样本可用(交联蛋白可逆交联后消化)。
Q: 磷酸化蛋白质组能做什么
1)信号通路分析(激酶-底物关系推断Kinase-Substrate Enrichment Analysis)；2)药物靶点验证(药物处理后磷酸化变化)；3)疾病标志物(肿瘤磷酸化差异)；4)激酶活性推断(磷酸化motif分析：AKT motif RXRXXS/T, MAPK motif SP/TP)；5)翻译后修饰网络调控。整合蛋白表达组+磷酸化组(区分表达变化和活性变化)。